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        致畸試驗

        發布時間:2021-12-30 15:05:55

        染色體畸變試驗-ISO 10993-3, GB/T 16886.3, OECD 473

        可用末梢血淋巴細胞,或人和哺乳動物體細胞系作為材料,常用的體細胞系有中國地鼠卵巢細胞(CHO),中國地鼠肺成纖維細胞(V79和CHL),人胚肺2倍體成纖維細胞等。這里介紹外周血淋巴細胞為對象的染色體畸變的試驗方法。

        實驗目的和原理:
        染色體畸變分為染色體結構畸變和數目畸變,染色體結構畸變又分為缺失、短片、互換等。
        在加入和不加入代謝活化系統的條件下,使培養的哺乳動物細胞暴露于受試物中,用中期分裂相阻斷劑(如秋水仙素或秋水仙堿)處理,使細胞停止在中期分裂相,隨后收獲細胞,制片,染色,分析染色體畸變。

        應用標準

        AAMI/ANSI/ISO 10993-3,  GB 16886.3 , OECD 473

        方法與步驟  

        1. 試劑 
        1)RPMI-1640培養液,含20%小牛血清。  
        2)肝素:每支含肝素12500U,使用時用生理鹽水配成500U/ml,4℃冰箱內保存備用。 
        3)秋水仙素:配成40ug/ml濃度。稱取秋水仙素4mg,溶解于100ml 0.85%Nacl 溶液中,經6號細菌漏斗過濾,4℃冰箱內保存。使用時吸取0.05或0.1ml加入到5ml細胞培養物中,其終濃度為0.4~0.8ug/ml。 
        4)雙抗:青霉素100U/ml,鏈霉素100ug/ml。 
        5)PHA:PHA為冰干注射劑(廣州生產)每支10mg,使用時用2ml生理鹽水溶解。 
        6)KCl低滲液:KCl 1.88g,雙蒸水1000ml使之溶解,其濃度為0.025M.
        7)冰醋酸甲醇固定液:冰醋酸1份,甲醇3份,混合而成。 
        2. 細胞培養 常規細胞培養 
        3. 受試物的處理 
        實驗分組:至少設立五個組,即陽性對照、陰性(溶劑)對照及三個劑量組。最高劑量和最低劑量之間相差10倍,中間再設一個劑量,陽性對照物為已知的染色體斷裂劑,如絲裂霉素C(MMC),劑量為0.02μg/ml;黃曲霉素毒素B1,濃度為10-6M等。每組中應設2~3個平行樣品。  
        4. 操作步驟  
        1)收集細胞:經受試驗處理的細胞,培養開始后52~72h收集細胞。依不同受試物而有所差異。  2)加入秋水仙素:培養終止前于培養物中加入40μg/ml秋水仙素0.05-0.1ml,終濃度為0.4~0.8μg/ml,37℃下培養4h。 
        3)低滲處理:小心取出細胞培養物,棄去上清液,細胞沉淀在瓶底(體細胞須經胰酶消化),加入8ml KCl低滲液,用滴管輕輕吹打制成細胞懸液,移入10ml刻度離心管中,37℃下處理20min。  4)離心:1000轉/min,離心7~10min,棄去上清液,收集細胞,加入Hanks液。 
        5)固定:加入1:3冰醋酸甲醇固定液3ml預固定,用滴管輕輕吹打,立即離心,收集細胞,再加入10ml上述固定液,處理15min,反復操作兩次,每次15min。 
        6)制片:棄去固定液,再加入適量新鮮固定液,混勻。取出預冷的載玻片,每片滴加1~2滴細胞懸液,用嘴輕輕吹散,或用滴管吸取少許細胞懸液,在40~50㎝高度上對準下面玻片滴加懸液,以沖力使細胞分散。自然干燥或用微熱電吹風機吹干,也可在酒精燈火焰上略加烘烤。此時可在顯微鏡下檢查有無分裂相細胞。 
        7)染色:用Giemsa 染液染色15min,用自來水輕輕沖洗殘留染液,待干。  
        8)鏡檢:先在低倍鏡下尋找分散良好的分裂相細胞,然后用高倍鏡或目鏡觀察,進行染色體畸變計數,分析,分別記錄染色體畸變細胞數及各種類型染色體畸變細胞數,選擇良好的典型的染色體畸變圖進行顯微照相。  
        5. 結果表示 
        1)染色體總畸變率及畸變率:     總畸變率(%)=各種畸變類型數/分析總細胞數×100         畸變率(%)=染色體畸變數/染色體總數×100  
        2)畸變類型分析:包括斷片(F)、雙著絲粒(D)、環(R)、互換(E)等,電力輻射常見斷片、雙著絲粒、環等,而化學毒物常見單體斷裂。
        6. 注意事項  
        1) 接種的血樣要新鮮,如不立即培養,應放在4~25℃溫度下,于24h內作培養。
        2) 培養箱溫度以37±5℃為宜。  
        3) 培養過程中如發現血樣凝集,可將培養瓶輕輕震蕩,使凝塊散開,然后繼續培養。
        4) 如低滲處理不當,染色體聚集一團,可將固定時間延長數小時或過夜,熱低滲過度,往往細胞全部破碎,造成染色體丟失。
        5) 離心速度過快,細胞團不易打散,速度過低,則使分裂相細胞大量丟失。 
        6) 玻片要嚴格清潔,使細胞均勻鋪開。

        周期

        測試周期如下表所示:

        產品

        測試周期

        醫療器械

        6-8周,詳細請聯系

        藥物

        6-8周,詳細請聯系

        藥物接觸材料

        6-8周,詳細請聯系


        送樣要求

        ISO 10993標準: 固體或粉末狀: 6個完整樣品,每個樣品需60 cm2 或 4 g及以上; 液體或化學品:25ml及以上


        GB 16886標準:  固體或粉末狀: 6個完整樣品,每個樣品需60 cm2 或 4 g及以上; 液體或化學品:25ml及以上


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