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    ames試驗

    發布時間:2021-12-30 15:06:21

    Ames鼠傷寒沙門氏桿菌回復突變試驗-ISO 10993-3, GB/T 16886.3, YY/T 0127.10

    Ames試驗全稱鼠傷寒沙門氏桿菌回復突變試驗。
    實驗目的和原料:
    鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)的組氨酸營養缺陷型(his-)菌株,在含微量組氨酸的培養基中,除極少數自發回復突變的細胞外,一般只能分裂幾次,形成在顯微鏡下才能見到的微菌落。受誘變劑作用后,大量細胞發生回復突變,自行合成組氨酸,發育成肉眼可見的菌落。某些化學物質需經代謝活化才有致變作用,在測試系統中加入哺乳動物微粒體酶,可彌補體外試驗缺乏代謝活化系統之不足。

    應用標準

    ISO 10993-3, GB/T 16886.3, YY/T 0127.10

    Ames試驗的常規方法有斑點試驗和平板摻入試驗。

    1.菌株鑒定
    用于測試的菌株,需經基因型和生物學性狀鑒定,符合要求才能投入使用。
    目前推薦使用的一套菌株是TA97、TA98、TA100和TA102。鑒定前先進行增菌培養。為鑒定結果可靠,需同時培養野生型TV菌株,作為測試菌基因型之對照。增菌培養用牛肉膏蛋白胨液體培養基,接種后于37℃,100r/min振蕩培養12h左右,細菌生長相為對數期末,含菌數應為1×109個/ml~2×109個/ml。
    鑒定項目:
    (1)脂多糖屏障丟失(rfa)用接種環或一端撓起的接種針以無菌操作術取各菌株的增菌培養液,在營養瓊脂平板上分別劃平行線,然后用滅菌尖頭鑷夾取滅菌濾紙條,浸濕結晶紫溶液,貼放在平板上與各接種平行線垂直相交。蓋好皿蓋后倒置于37t溫箱,培養24h后觀察結果。
    (2)R因子 劃線接種,貼放濾紙條及培養等均同上,唯濾紙條浸濕的藥液不同,為氨芐青霉素鈉溶液。TA102除pKM101外,還有pAQ1,載有抗四環素的基因,故另用濾紙條浸濕四環素溶液后貼放于劃線接種的平板上。
    (3)紫外線損傷修復缺陷(△uvrB)在營養瓊脂平板上按上述方法劃線接種后,一半接種線用黑玻璃遮蓋,另一半暴露于紫外光下8sec,然后蓋好皿蓋并用黑紙包裹平皿,防止可見光修復作用。培養同上。
    (4)自發回變 預先制備底平板;向滅菌并在水浴內保溫45℃的上層軟瓊脂中注入0.1ml菌液;混勻后傾于底平板上并鋪平。平皿倒置于37℃溫箱培養48h。
    (5)回變特性——診斷性試驗 上層軟瓊脂中除菌液外,還注入已知陽性物之溶液,需活化系統者并加入S9mix,余同上。
    組氨酸營養缺陷型由自發回變即可知。
    2.斑點試驗
    吸取測試菌增菌培養后的菌液0.1ml,注入融化并保溫45℃左右的上層軟瓊脂中,需S9活化的再加0.3ml-0.4mlS9mix,立即混勻,傾于底平板上,鋪平冷凝。用滅菌尖頭鑷夾滅菌圓濾紙片邊緣,紙片浸濕受試物溶液,或直接取固態受試物,貼放于上層培養基的表面。同時做溶劑對照和陽性對照,分別貼放于平板上相應位置。平皿倒置于37℃溫箱培養48h。在紙片外圍長出密集菌落圈,為陽性;菌落散布,密度與自發回變相似,為陰性。
    3.平板摻入試驗
    將一定量樣液和0.1ml測試菌液均加入上層軟瓊脂中,需代謝活化的再加0.3ml-0.4ml S9mix,混勻后迅速傾于底平板上鋪平冷凝。同時做陰性和陽性對照,每種處理做3個平行。試樣通常設4個~5個劑量。選擇劑量范圍開始應大些,有陽性或可疑陽性結果時,再在較窄的劑量范圍內確定劑量反應關系。培養同上。同一劑量各皿回變菌落均數與各陰性對照皿自發回變菌落均數之比,為致變比(MR)。MR值≥2,且有劑量-反應關系,背景正常,則判為致突變陽性。

    周期

    測試周期如下表所示:

    產品

    測試周期

    醫療器械

    6-8周,詳情請聯系

    藥物

    6-8周,詳情請聯系


    送樣要求

    ISO 10993-3標準:固體或粉末狀: 3個完整樣品,每個樣品需60 cm2 或 4 g及以上; 液體或化學品:15ml及以上

    GB/T 16886.3標準:固體或粉末狀: 3個完整樣品,每個樣品需60 cm2 或 4 g及以上; 液體或化學品:15ml及以上

    YY/T 0127.10標準: 固體或粉末狀: 3個完整樣品,每個樣品需60 cm2 或 4 g及以上; 液體或化學品:15ml及以上



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